im电竞脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸分歧位子引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸，催化脱饱和响应，从而出现单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。行为脂肪酸合成途径中的症结酶出席脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键位子、组织、数目出现特异性影响，不单可能添补脂肪酸的不饱和度，尚有利于督促脂质积攒，对庇护生物膜寻常组织和功效拥有苛重道理。斟酌注解，不管是单表达照旧共表达去饱和酶基因，都可正在必定水准上普及微生物的油脂含量、改革其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的症结酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，告竣这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，得回高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的开辟和使用供给技能支持。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品举办检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期目的条带巨细相符，注解这些基因片断扩增胜利。

　　重组表达质粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，划分采用控造性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均出现两条带（图2），个中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度相同，幼片断划分与de1、de2、de基因的方针片断长度相同，进一步测序结果表明3 个基因的重组表达质粒均修筑胜利。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）获得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株举办PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌修筑胜利。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE分解

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白举办SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果举办对照分解，展现工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质地约40、32 kDa把握的条带划分较 E.coli BL21（DE3）彰彰加深，与表面分子质地较贴近（DE1的为39.8 kDa，DE2的为31.8 kDa）。结果注解，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中告竣了高效单表达和共表达。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE作育6 0 h内的OD 600nm 举办监测，其成长弧线 h把握完成长峰值，其后成长趋于不变。从作育经过的成长弧线 株菌株暴露与野生菌株肖似的成长弧线，阐明表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达经过中，工程菌株仍能庇护有用的成长。然而，24～60 h，工程菌株的成长均略低于野生菌株，能够因为表源基因表达经过中，插入新的酶会变成合成代谢滋扰内源性代谢，合成代谢和内源性代谢之间的比赛导致代谢肩负，从而导致宿主的应激响应和心理改变，惹起工程菌株成长量的低浸。

　　红四氮唑行为一种氧化剂，可能从去饱和酶承担电子，后自己从无色被还原为赤色的甲攒，从而可能表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性改变弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导经过中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，划分为同时辰野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，注解去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即告竣了高程度的表达；24 h后工程菌株酶活性呈消浸趋向，能够是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中酿成洪量的海涵体。而发酵后期跟着养分物质破费以及细菌成进步入阑珊期 ，去饱和酶活性趋于平定，但仍略高于或与野生菌株的酶活性贴近。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水准扫除能够因为海涵体的酿成导致一面菌株去饱和酶活性消浸食品，而变成后续试验对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的试验过错，本斟酌仅征求了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品举办细菌油脂的提取及其脂肪酸组分分解。

　　如图6所示食品，去饱和酶基因的表达有用巩固了细菌脂质的积攒，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质地分数均明显普及。DE1、DE2、DE的油脂产量划分可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株普及83%以上，而油脂质地分数从野生菌的9.45%普及至18.44%以上，划分较野生菌株普及97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量普及的督促影响明显优于这两个基因单表达的，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因督促脂质积攒恶果更明显的结论相同。

　　将提取的细菌油脂举办甲酯化后，欺骗气相色谱对脂肪酸组分举办定性和定量分解。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品举办星散定性，对比模范品参考图谱得出各组分的出峰功夫，采用十五烷酸甲酯行为内标对脂肪酸甲酯举办定量分解。菌株脂肪酸组分及其质地分数见表3。

　　表3显示，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质地分数却爆发了彰彰的改变。个中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质地分数均高于野生菌株，加倍是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质地分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2、DE相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的普及量。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均普及，饱和脂肪酸含量划分普及72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量划分普及112.18%、44.18%、134.30%，注解去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改革。

　　表面上，去饱和酶特异性地督促成熟脂肪酸中顺式双键的酿成，将饱和形态下的脂肪酸去饱和，症结组织域和症结位点组成去饱和酶的活性中央并影响其活性，且分歧的催化底物对催化速度也出现必定的影响。有斟酌注解，脂肪酸去饱和酶的类型、表达程度和活性决断了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，迥殊去饱和酶的过表达可能督促细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质积攒，从而到达改革脂肪酸组分的恶果。本斟酌通过对工程菌株相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的普及量举办统计分解，声知道去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改革，加倍是不饱和脂肪酸含量的普及食品。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量改变的斟酌结果，可见去饱和酶看待脂肪酸组分的改革至闭苛重，过表达分歧泉源的去饱和酶基因看待高产油工程菌或迥殊组分工程菌的修筑拥有苛重使用价钱和表面道理。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，修筑了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，告竣了去饱和酶基因的高表达，有用督促了E.coli去饱和酶活性的普及，使脂肪酸积攒量得以添补，普及了菌株油脂产量和含量，改革了脂肪酸组分，加倍使不饱和脂肪酸含量明显普及。本斟酌可为产油脂工程菌的开辟和使用供给有价钱的菌种泉源，对高效产油工程菌的修筑拥有必定的使用价钱。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》泉源于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景，许思远，张 琴，钱 程，曹娟娟，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076。点击下方 阅读原文即可查看作品相干音信。

　　熟练编纂：天津贸易大学生物技能与食物科学学院 梁雯菁；负担编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片泉源于作品原文及摄图网。

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